摘要：最新的3D细胞培养方法的促进了复杂的生理模型和组织结构的开发。通过借鉴材料制造领域的进步，3D生物打印技术可以实现制造具有可控尺寸、间距和化学功能的细胞结构。以前研究人员无法对工程组织结构进行高度控制，从而限制能够生成更复杂的、生理相关的3D组织结构。本文回顾三种主要的3D生物打印技术——挤压、基于液滴和激光辅助的生物打印技术及其优点和缺点。通过3D生物打印创建的高复杂结构组织为军事医学研究人员开辟了组织工程、再生医学和生理模型新途径。
背景介绍
军事行动造成的外伤，如烧伤、皮肤及组织的缺损、骨骼及软骨组织的创伤很常见。军事医学需要将服役人员从这些创伤中迅速康复放在优先事项。目前再生医学已从2D向3D培养技术发展。3D细胞培养更接近于正常的人类生理条件。通过3D培养技术，研究人员已经能够开发出新的组织和/或疾病的体外模型，更准确地反映人体生理病理。衍生出的3D生物制造可用于：(1)科学研究的研究工具；(2)制造替代组织或组织产品以直接应用（例如移植）到患者体内。在第一种情况下，组织模型，可代表健康或病变组织，是用于识别生物标志物、体外药物测试和疾病状况调查的宝贵工具。在第二个应用中，生物制造的组织产品用于体内使用，用于替换受损组织或显著增加伤口愈合。后者最常见的应用是使用皮肤覆盖烧伤伤口或作为自体移植物。3D生物打印的使用可以提供制造满足这两种应用所需的3D组织结构所需的再现性和精度。
3D打印
3D打印是一种增材制造过程，其通过沉积连续的二维(2D)材料层来制造复杂结构，以生产3D对象。可移动的打印头在X-Y方向的每一层跟踪图案，第三维(Z)来自平台或打印头随时间的垂直移动。使用这种方法，可以设计和制造复杂形状，超越传统加工工具的限制。3D生物打印借鉴3D工业打印技术，开发出构建复杂生物结构和开发不同组织器官模型的方法，使用生物墨水、水凝胶及热塑性材料。生物墨水是一种具有物理、化学和机械特性的生物材料，可以将其打印成3D结构，其化学结构和内在离子电荷，可隔离水并为细胞提供结构支持，类似于大多数人体组织中天然ECM周围细胞的结构支持。许多水凝胶可以在打印前装载细胞，或者可以在打印和凝胶化后接种细胞。当水凝胶中包含细胞时，需要更严格的处理条件以确保细胞活力；生物墨水通常保持在体温或接近体温，并且使用更适合细胞的凝胶条件和交联剂。热塑性材料通常用于结构或机械支撑，在骨骼和骨软骨组织工程中常见。这些聚合物可以与其他非生物材料（如羟基磷灰石或石墨烯）混合，以改善打印结构的机械性能并影响接种到这些支架上的细胞的行为。
3D生物打印方法
图1 挤压生物打印方法
1.挤压式生物打印挤压系统在生物打印中很受欢迎，通过使用气压、柱塞或机械螺钉分配生物墨水来发挥作用（图1）。挤压3D生物打印机能够打印多种材料，包括合成生物相容性聚合物、生物聚合物（例如胶原蛋白）和致密的细胞悬浮液。生物相容性合成聚合物通过加热熔化或溶解在溶剂中，挤压成所需的图案，然后通过冷却或溶剂蒸发固化。挤压部件用于形成更坚固、更坚固的脱细胞支架，随后可以对其进行修饰或接种细胞，在骨和软骨组织工程中常见。天然生物聚合物和生物相容性聚合物通常被挤出为生物墨水水凝胶。水凝胶生物墨水也可以装载细胞。
挤压生物打印的优点：基于挤压的3D生物打印系统与其他生物打印方法相比具有多个优势，包括可扩展性、生物墨水多样性和高细胞密度沉积。挤压很容易用于大规模生产和规模化。挤压打印的范围从细胞球体到脱细胞ECM水凝胶。挤压打印是目前唯一可行的生物打印超高密度生物墨水的方法。由于典型的人体组织由密集的细胞组成，因此体内使用构建体都需要高密度打印细胞。挤出生物打印的缺点：挤出3D生物打印的缺点包括制造速度慢、细胞活力较低和分辨率有限。挤压系统往往很慢，线性印刷速度受印刷材料的粘度和凝胶动力学限制。较长的构建时间会影响细胞活力，尤其是在打印过程中细胞无法获取营养的情况下。细胞生存能力低于其他生物打印方法。挤压生物打印已用于军事医学相关的组织和模型的打印。肌肉骨骼损伤在年轻军人群体中很常见。出了骨骼损伤之外，另一个易损伤部位是半月板。半月板的挤压生物打印模型使用热塑性塑料来增加机械支撑，使用间充质干细胞进行种子构建，以分化为负责半月板重塑的软骨细胞。但其缺点在于机械性能较差，且会过早磨损。在军人中经常观察到由于外伤导致的体积性肌肉损失。生物打印肌肉主要集中在心脏和肌肉骨骼系统；生物打印心肌细胞可以产生同步收缩，而生物打印骨骼肌的对齐结构可用于诱导肌原纤维形成和类似的分层结构。骨骼肌结构在移植到实验动物中时能够产生收缩力并发挥作用，仍需进一步的试验用于人体。挤压生物打印技术在生物打印的皮肤模型中也很普遍。将这些模型转化为临床还需要做更多的工作，但这项技术在治疗战士遭受爆炸和烧伤等方面具有明显的潜力。
2.液滴生物打印液滴生物打印技术建立在喷墨打印机开发的技术之上。在这种打印方式中，生物墨水形成皮升体积的液滴并通过喷嘴分配（图2）。液滴生物打印的核心是生物墨水粘度和凝胶化之间的相互作用，以及它们如何影响生物墨水沉积。液滴生物打印中使用的生物墨水必须比挤压系统中使用的生物墨水具有更低的粘度。已经开发出将生物墨水液滴打印到其他液体中的方法，以在凝胶化发生时保持球形形状和液滴体积，这适用于几乎所有与生物打印相关的组织。
图2 液滴生物打印
液滴生物打印的优点：细胞活力通常高于挤压系统；液滴生物打印还受益于提供出色空间分辨率的小液滴尺寸；液滴系统比挤压或激光辅助生物打印系统便宜，且对用户更友好。与传统的2D培养相比，液滴系统允许更精确和统一地放置多种细胞类型并控制其局部微环境。液滴生物打印的缺点：对较低粘度和快速凝胶化的要求也需要较低的总细胞密度，因为较高的密度会显着增加生物墨水的粘度。高生物墨水粘度会导致喷嘴堵塞，从而导致整个印刷过程中止。液滴生物打印结构的整体尺寸受到限制，尤其是与挤压生物打印相比。
液滴生物打印在军事医学中的应用包括皮肤、半月板和平滑肌打印。许多这些组织模型使用明胶、藻酸盐或基于胶原蛋白的生物墨水。与挤压打印相比，液滴系统的体积吞吐量较小，骨骼和骨骼肌液滴打印落后于其他领域。液滴可结合挤压共同应用，使用挤压创建更大的散装水凝胶并使用液滴生物打印沉积具有更高空间分辨率的细胞，克服了个体生物打印的局限性。液滴生物打印在空间分辨率方面可能具有优势的军事医学相关领域之一是打印脉管系统。创建功能性脉管系统是将3D生物打印组织结构转化为有用的组织再生临床的最大障碍。使用带有支持介质的液滴打印技术使喷墨生物打印能够创建具有管腔和分叉的复杂血管结构。尽管液滴生物打印的分辨率目前不允许在小动脉或毛细血管大小尺度上打印功能性微血管系统，但生物打印技术的进步继续扩大了可能的极限。
3.激光生物打印激光诱导正向转移（也称为激光生物打印）生物打印方法使用聚焦激光脉冲将材料从支撑“目标”转移到“接收”基材。生物墨水水溶液（细胞或其他生物活性成分）散布在吸收层的顶部，激光束聚焦到目标基板和吸收金属的界面。一旦发生脉冲，激光会导致界面附近皮升体积的生物墨水热挥发，从而产生微气泡（图3）。这种微泡的产生和膨胀导致微升体积的生物墨水液滴向接收基板喷射。通过使用计算机控制的平移台，可以在特定位置将液滴沉积到接收基板上，便液滴落在特定位置。整个过程不会导致细菌或哺乳动物细胞丧失活力或DNA损伤。
图3 激光生物打印
激光生物打印的优点：没有传统打印喷嘴意味着可以打印粘度更高的生物墨水；可以轻松改变具有不同材料特性或细胞成分的生物墨水；使用激光来驱动微升大小的液滴沉积用于非常高精度的打印。根据激光频率和目标平移速度，可以在一秒钟内打印数百个液滴。打印的生物墨水的细胞密度也可以很容易地进行调整，这样每个单独的激光脉冲都会导致单个细胞沉积在接收基板上，能够非常精确地定位多种细胞类型和ECM组件，同时还提供对细胞之间3D相互作用的前所未有的控制。激光生物打印的缺点：系统的复杂性；必须设置在无菌环境中，以确保最终产品的无菌性；操作的复杂性；价格高昂；沉积材料的体积受限；随着时间的推移，整体体积沉积较差，并且需要维护接收基板环境；最后，必须在印刷前准备和维护目标基材。激光生物打印在军事医学中的应用最显著的是皮肤和骨骼。其高分辨率图案已被用于打印多层皮肤结构，包括角质形成细胞和成纤维细胞，作为烧伤治疗的一种治疗方法。打印的组织成功地移植到小鼠身上并形成了小血管。该方法已用于原位骨打印，这是另一个具有重大军事意义的领域。研究人员使用该方法将骨传导间充质干细胞直接打印到小鼠模型中的骨损伤处，在两个月内观察到骨缺损中心骨形成和伤口修复显著增加。针对骨生物材料（如羟基磷灰石）的激光打印也在体外生成骨组织方面取得了成功。利用该技术快速治疗战场上遭受的外伤性骨损伤或制造用于手术植入的生物活性骨插入物可以更快地促进恢复并返回工作岗位。
展望和未来方向
在这些技术进入临床之前，必须解决工程、材料、医学和监管方面的挑战。在工程方面，特征更小、空间分辨率更高的零件需要更长的时间来打印。较新的技术，如立体光刻生物打印，正开始解决这些缺点。然而，这些技术有其自身的局限性，必须通过额外的创新或与其他生物打印方式的结合来解决。生物墨水目前在复杂性、细胞兼容性和可印刷性方面受到限制。创建能够重现机械和化学线索、保持细胞活力、同时保持可打印的生物墨水的挑战需要化学家、生物学家和工程师的努力。在改进生物打印过程和生物墨水的同时，研究人员和临床医生必须确定功能性生物制造组织的构成。例如，神经支配是生物打印研究的一个活跃领域，但目前大多数生物打印组织结构都缺乏神经支配，并且需要完全恢复组织功能。需要为3D生物打印组织的大规模生产开发监管框架和制造基础设施。为了广泛开展和批准生物打印组织，需要解决组织和生物墨水材料的一致性、安全性和有效性。
结论
3D生物打印技术正在迅速发展。当前的研究重点是提高这些技术打印的材料和细胞类型的速度、空间分辨率和多样性。生物打印在转化再生医学应用方面取得了突破性进展，并为基础和应用研究提供了新的组织模型。基于挤压的3D生物打印允许使用从水凝胶到热塑性塑料的各种生物材料以较低的空间分辨率打印更大的结构。基于液滴的3D生物打印具有比挤出技术更好的空间分辨率，但可打印的材料范围更窄，因为打印头需要较低粘度的墨水。激光辅助生物打印提供极高的精度和细胞活力，但该系统昂贵且复杂，并且无法构建像挤出和液滴生物打印那样大的结构。3D生物打印可直接应用于军事医学基础研究，例如环境暴露调查、药物发现以及爆炸伤等损伤建模。这项技术还有望在再生医学中用于治疗受伤的战士，例如烧伤患者的皮肤，以及常见的肌肉和/或神经损伤。
