COX蛋白是在前列腺素合成过程中的速率决定酶，COX酶分为两种，即COX-1和COX-2。最近相关的研究表明，COX-2的过表达会诱导多种炎症反应，并最终导致细胞死亡。同时，COX-2也会在多种癌症中进行表达，促进细胞的癌变，血管生成以及化疗的抗性。所以，研究诱导COX-2蛋白表达的信号通路尤为重要。同时，c-di-GMP也已经被证明是一种免疫刺激分子，常常通过激活STING-TBK1途径来触发宿主的免疫反应（如图1所示）。各种环状二核苷酸，诸如c-di-GMP以及c-di-AMP等等小分子所参与的信号通路已经成为了癌症免疫治疗的重要靶点。但是，对于这些环状二核苷酸在一些炎症途径中的作用目前还不清楚。 本文中，作者通过研究c-di-GMP与COX-2之间的关系，清晰的描绘了c-di-GMP，COX-2与炎症响应之间的关系。
图1. cGAS-STING途径及各种核苷酸参与的信号通路
首先，为了测定COX-2，作者抑制了COX-1的活性，以免对于实验产生干扰，接下来，作者将LPS和一系列的核苷酸分别刺激巨噬细胞。LPS作为阳性对照组，对COX-2的活性具有显著的提升，同时可以观察到c-di-GMP处理过后的细胞也会出现类似的增加（图2a），但是作者在采用c-di-AMP以及2′,3′-cGAMP刺激原始巨噬细胞的时候，却没有观察到COX-2活性的提升。同时作者还进一步的测试了其他的二核苷酸类似物，包括c-di-IMP，3′,3′-cGAMP等等。所有的这些类似物都会进入免疫细胞并且结合STING蛋白，最终激活IRF3，但是这些类似物却都不能激活COX-2的活性，最终只有c-di-GMP能够引起COX-2蛋白表达的提升（图2b，c）。这表明c-di-GMP对于COX-2蛋白的表达具有独特的上调能力以及相当强的选择性。同时，为了验证c-di-GMP对于COX-2蛋白的差异诱导作用，作者通过免疫印迹对于COX-2的表达进行了表征。结果证明确实只有作为阳性对照组的LPS以及c-di-GMP可以诱导COX-2蛋白的表达（图2e）。在确定COX-2对于c-di-GMP的特征响应之后，作者在时间尺度上测试了c-di-GMP对于COX-2表达的上调，可以看出随着时间的延长，c-di-GMP对于COX-2的表达的上调也出现了提升。作者同样进行了western blot验证了时间尺度上对于诱导的影响（图3）。
图2. c-di-GMP对于COX-2蛋白表达的上调作用
图3. c-di-GMP对于COX-2的时间尺度上的影响
接下来，作者试图验证c-di-GMP诱导COX-2上调的过程的相对于STING蛋白的独立性，首先，加入STING蛋白的促进剂对于COX-2的表达并没有显著的影响（图4a），之后，作者构建了敲除掉STING蛋白的细胞系，并且在该细胞系下验证了，即使敲除掉STING蛋白，LPS以及c-di-GMP依然可以诱导COX-2蛋白的表达（图4b，c）。这表明该信号通路不需要STING蛋白的参与。
图4.验证c-di-GMP诱导COX-2的相对于STING的独立性
在文章的最后，作者同样也探索了c-di-GMP诱导COX-2蛋白表达的信号通路，因为c-di-GMP对于COX-2的诱导与LPS非常相似，而LPS在之前的报道中，是经由TPL2-MEK-ERK通路诱导了COX-2蛋白的表达，因此作者做出合理假设，c-di-GMP同样通过此通路诱导，并且进行了一系列的抑制实验，例如加入Revoxertimib这样的ERK的抑制剂，会明显观察到COX-2蛋白表达的下降。同时如果加入TPL2抑制剂，也会进一步导致COX-2表达的下降（图5b，c）。这证明了c-di-GMP是通过TPL2-MEK-ERK途径诱导了COX-2蛋白的表达。
图5. c-di-GMP诱导COX-2表达的信号通路探究
综上所述，作者发现了c-di-GMP可以在没有STING蛋白的参与下，通过TPL2-MEK-ERK通路促进COX-2蛋白的表达，发现了一条二核苷酸促进COX-2表达的全新信号通路，为后面临床上的免疫治疗提供了新的思路。
