信号素核苷酸参与了许多的生理过程，(p)ppGpp在细菌和叶绿体中充当第二信使，(p)ppApp则是抑制细菌生长的毒素效应物。RSH（RelA-SpoT Homologue）家族的酶参与了这些信号素的合成与水解，而(p)ppGpp和pppGpp通过与酶的直接或者別构调节位点相结合，参与翻译，转录，复制和代谢过程。由于这些核苷酸具有化学和酶促作用，在结构生物学实验中容易被降解，给研究RSH家族酶的作用机制带来了困难。在本文中，作者设计了信号素核苷酸的类似物(p)ppNuNpp，该类似物能够有效地防止水解，并成功调节酶的构象。
在RSH家族中，单功能的RelA酶和双功能的Rel酶被研究得最为透彻。双功能的RSH酶具有两个相对的合成（SYNTH）和水解（HD）结构域，其中合成活性通过(p)ppGpp与N端酶催化结构域（NTD）结合来激活，此时HD结构域则会处于关闭状态（图1. F）。为了探究(p)ppGpp在结构生物学实验中的可行性，作者将金黄色葡萄球菌中的Rel酶的NTD结构域进行结晶，并采用高浓度的ppGpp进行浸润实验。结果发现不论是SYNTH还是HD结构域均处于关闭状态。HD结构域的活性位点部分变得无序，SYNTH结构域则被HD结构域遮挡。除此之外，在晶体表面还发现了一些水解产物（图1）。由此说明，天然的信号素核苷酸难以用于结构生物学研究。
图1.金黄色葡萄球菌Rel酶NTD结构域和pppGpp的复合物晶体结构(A)pppGpp分别占据HD、SYNTH两个结构域活性位点所形成的HDOFFSYNTHOFF结构。(B)该情形下的HD结构域活性位点电子密度。(C)该情形下的SYNTH结构域活性位点电子密度。(D)水解产物ppoG2’3’cp在晶体表面的电子密度。（E）不同底物与Rel NTD结合的晶体重叠示意图，展示了复合物处于HDOFFSYNTHOFF闭锁状态的结构因素。（F）Rel NTD结构域内SYNTH和HD结构域的交互影响Rel酶活。
为了克服这一问题，作者开始着手设计一个不可水解的信号素核苷酸类似物。在此前的文献报导中，GppNHp是GTP的不可水解类似物，并用于研究GTPase相关的结构生物学信息，由于P-O键被P-N键代替，该类似物获得了抵抗水解的能力。作者从中获取灵感，决定将(pp)Nupp的3’P-O键替换为P-N以获取对于RSH酶水解活性的抵抗（图2）。他们对(p)ppNuNpp进行了逆合成分析，并优化得到两条合成路线，得到了(p)ppGpp和(p)ppApp等四种信号素核苷酸（图2）。
图2. (p)ppNuNpp逆合成分析
接下来，他们对于ppGNpp/pppGNpp的适用性进行了评估。他们比较了天然信号素核苷酸及该类似物对大肠杆菌RelA酶和枯草芽孢杆菌Rel酶的合成活性的影响。可以发现，高浓度的ppGNpp/pppGNpp较之天然的ppGpp/pppGpp具有更强的抑制效果（图3. A-H）。而且通过EC50可以看出，pppGNpp表现出对于別构位点更强的亲和性。他们还利用了等温滴定量热法确定ppGNpp对枯草芽孢杆菌Rel酶的亲和力比ppGpp高出五倍。他们还测试了ppGNpp对于酶水解活性的作用。他们利用单水解活性酶MESH1和双功能酶Rel进行实验，发现ppGNpp能够与ppGpp竞争，从而有效地抑制酶的水解活性（图4）。这两部分实验可以说明，ppGNpp是一种有效的分子工具。
图3.信号素和对应的不可水解类似物对于大肠杆菌RelA (A-D)和B. Subtilis Rel.（E-H）的酶活影响。
图4. MESH1:ppGNpp相互作用的生化分析
最后，他们将嗜热链球菌Rel酶与pppGNpp共结晶，研究不可水解类似物与酶结合的结构信息。在20°C下获得的RelTtNTD:pppGNpp复合物中，HD活性位点催化所必需的所有残基的排列与 4°C下获得的RelTtNTD:ppGpp复合物中的残基类似，pppGNpp的结合方向与ppGpp相同。HD结构域催化位点中存在完整pppGNpp，直接证明了不可水解的类似物能够抵抗HD活性RSH的切割。重要的是，Mn2+配位与在RelTtNTD:ppGpp复合物中观察到的完全相同。因此氮取代氧对于pppGNpp与酶的结合没有影响，反而使其能够抵抗水解。
图5.嗜热链球菌Rel酶NTD结构域和pppGNpp的复合物晶体结构
综上，作者设计了信号素核苷酸ppNupp的不可水解类似物ppNuNpp并成功将其应用于RSH酶家族的结构研究中。该类似物后续可以用于X射线，结晶，冷冻电镜研究等，还有核磁共振等需要长时间数据采集的实验中。将来，还可以考虑在核糖的2-6号位进行改造，已获得更多更有效的不可水解类似物，甚至实现交联，富集等其他实验需求。
