SARS-CoV-2是已知第7种可以感染人类的冠状病毒；其中，SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2都能够引发严重疾病，而HKU1、NL63、OC43和229E只与轻微症状有关6。本文中，我们通过对基因组数据进行比较分析，尝试推断SARS-CoV-2的起源。我们探讨了SARS-CoV-2基因组的显著特征，以及这些特征的可能起源。我们的分析清楚地显示，SARS-CoV-2既非实验室产物，也非蓄意改造的病毒。
SARS-CoV-2基因组的显著特征
通过比较α冠状病毒和β冠状病毒，我们发现了SARS-CoV-2基因组的两个显著特征：（i）根据结构研究7,8,9和生化实验1,9,10，SARS-CoV-2似乎经过了优化，很容易与人ACE2受体结合；（ii）由于12个核苷酸的插入，SARS-CoV-2的刺突蛋白在S1和S2连接处有一个功能性多碱基（弗林蛋白酶）切割位点8，从而可以推测这一位点附近有3个O连接聚糖。
1. SARS-CoV-2受体结合域的突变
刺突蛋白的受体结合域（receptor-binding domain，RBD）是新冠病毒基因组中最为多变的部分1，2。已有研究证实，RBD的6个氨基酸对于结合ACE2受体以及确定SARS-CoV样病毒的宿主范围至关重要7。在SARS-CoV中，这6个氨基酸分别是Y442、L472、N479、D480、T487和Y4911，对应SARS-CoV-2中的L455、F486、Q493、S494、N501和Y5057。6个氨基酸中的5个在SARS-CoV和SARS-CoV-2之间存在不同（图1a）。结构研究7，8，9和生化实验1，9，10表明，SARS-CoV-2的RBD似乎能与人类、雪貂、猫以及其他受体同源性较高物种的ACE2受体发生高亲和力结合7。
图1：人SARS-CoV-2及其近缘冠状病毒的刺突蛋白特征。a，SARS-CoV-2刺突蛋白的结合氨基酸中的突变。SARS-CoV-2刺突蛋白（顶部红色条）与亲缘关系最近的SARS-CoV样冠状病毒，以及SARS-CoV本身的对比。蓝色框表示SARS-CoV-2以及SARS-CoV（Urbani毒株）等近缘病毒中，与ACE2受体结合的刺突蛋白的关键氨基酸。b，多碱基切割位点及O连接聚糖的获得。多碱基切割位点及附近三个推测的O连接聚糖都是SARS-CoV-2所独有的特征，之前在β冠状病毒B谱系中从未发现过。图中序列来自于NCBI GenBank数据库，序列号为MN908947、MN996532、AY278741、KY417146以及MK211376。穿山甲冠状病毒序列来自于SRR10168377和SRR10168378（NCBI BioProject PRJNA573298）29，30。
虽然上述分析指出，SARS-CoV-2或能与人ACE2进行高亲和力结合，但计算分析预测，这种相互作用并不是最理想的一种7；而且，SARS-CoV-2的RBD序列与SARS-CoV经过受体结合优化的RBD序列不同7，11。因此，SARS-CoV-2刺突蛋白之所以能与人ACE2进行高亲和力的结合，最有可能的原因是人ACE2或人样ACE2受到了自然选择，从而产生了另一种优化结合的方案。这一证据有力证明了SARS-CoV-2不是蓄意改造的产物。
2.多碱基弗林蛋白酶切割位点和O连接聚糖
SARS-CoV-2的第二个显著特征，是位于刺突蛋白S1和S2亚基连接处的多碱基切割位点（RRAR）8(图1b)。这使得弗林蛋白酶和其他蛋白酶能够进行高效切割，对于决定病毒传染性及宿主范围起到了一定作用12。此外，SARS-CoV-2在该位点处还插入了一个脯氨酸，插入序列为PRRA（图1b）。经推测，脯氨酸所形成的转角可能产生了SARS-CoV-2特有的、位于切割位点两边的三个O连接聚糖S673、T678和S686（图1b）。在亲缘关系相近的β冠状病毒B谱系中未曾观察到多碱基切割位点，尽管其他的人β冠状病毒，包括A谱系中的HKU1，也有类似切割位点和推测存在的O连接聚糖13。但从刺突蛋白的基因变异程度看，有可能还会在其他物种中发现存在部分或完整多碱基切割位点的SARS-CoV-2样病毒。
SARS-CoV-2中多碱基切割位点的功能序列尚不可知，这对于确定其在动物模型中的传播性和发病机制都很重要。针对SARS-CoV的实验表明，S1和S2连接处插入的弗林蛋白酶切割位点，能够增强细胞融合且不影响病毒进入14。此外，MERS-CoV刺突蛋白的高效剪切，使得蝙蝠体内的MERS样冠状病毒能够感染人类细胞15。而禽流感病毒在高密度鸡群中的快速复制和传播，使得血凝素（HA）蛋白中的多碱基切割位点被选择16，其功能与新冠病毒刺突蛋白的切割位点类似。HA蛋白通过插入或重组获得多碱基切割位点后，低致病性的禽流感病毒变成了高致病性病毒16。在细胞或动物中传代，也观察到了HA蛋白获得多碱基切割位点的过程17。
O连接聚糖的功能目前仍不明确，但可能会形成“粘蛋白样结构域”，从而掩护SARS-CoV-2刺突蛋白上的抗原表位和关键氨基酸18。一些病毒能在聚糖掩护免疫逃逸时利用粘蛋白样结构域18。尽管关于O连接聚糖的推测是可靠的，但仍需要进行实验性研究，来确定SARS-CoV-2的这些位点是否真的发挥了作用。
SARS-CoV-2的起源理论
认为是实验室对近缘SARS-CoV样冠状病毒进行改造，进而得到了SARS-CoV-2是不太可能的。正如上文所述，SARS-CoV-2的RBD经过优化与人ACE2高效结合的方式与之前预测的都不相同7，11。此外，如果真的进行过遗传改造，可能会用到β冠状病毒的几种反向遗传学操作系统中的一种19。然而，基因数据确凿地显示，SARS-CoV-2并非来源于之前用过的任何病毒基因骨架20。因此，我们对SARS-CoV-2的起源提出了两种合理的解释：（i）人畜共患前在某种动物宿主内发生的自然选择；（ii）人畜共患后在人体内发生的自然选择。我们还讨论了传代过程中的选择作用是否会导致SARS-CoV-2的出现。
1.人畜共患前在某种动物宿主内发生的自然选择
由于许多COVID-19的早期病例都与武汉华南海鲜市场有关1，2，那里可能存在着某种动物宿主。鉴于SARS-CoV-2与蝙蝠SARS-CoV样冠状病毒的相似性2，蝙蝠可能是其始祖病毒的储存宿主。尽管中菊头蝠（Rhinolophus affinis）样本中发现的RaTG131与SARS-CoV-2的整体相似性约达96%1，但两者RBD中的刺突蛋白并不相同，这表明RaTG13可能无法与人ACE2高效结合7（图1a）。
非法走私到广东省的马来穿山甲（Manis javanica）也携带与SARS-CoV-2类似的冠状病毒21。尽管在全基因组层面上，蝙蝠病毒RaTG13仍然是最接近SARS-CoV-2的病毒1，但一些穿山甲冠状病毒与SARS-CoV-2在RBD上的相似性却很高，包括RBD中全部6个关键氨基酸21（图1）。这清楚地表明，SARS-CoV-2刺突蛋白适合与人样ACE2结合是自然选择的结果。
到目前为止，从上述蝙蝠和穿山甲中得到的β冠状病毒，都没有多碱基切割位点。虽然还没有发现与SARS-CoV-2直系始祖十分相似的动物冠状病毒，但对蝙蝠等物种体内冠状病毒的采样存在多样性严重不足的问题。突变、插入和缺失都会发生在冠状病毒S1和S2连接处的附近22，这说明多碱基切割位点可以是自然演化的结果。如果前体病毒要同时获得多碱基切割位点，以及能够结合人ACE2的刺突蛋白突变，其动物宿主必须具有高种群密度（允许自然选择高效进行），还要有一个与人类同源基因相似的ACE2编码基因。
2.人畜共患后在人体内发生的自然选择
还有一种可能，SARS-CoV-2的一个前体病毒进入了人体，在未被发现的人传人过程中，通过适应性获得了上述的基因组特征。病毒一旦获得这些突变，这种适应性就能引发大流行，感染足够多的聚集性病例，引起监测系统的注意1，2。
到目前为止，所有已测序的SARS-CoV-2基因组都具有上述特征，因此它们都来自拥有相同基因组特征的共同祖先。穿山甲中存在着与SARS-CoV-2非常相似的RBD，我们可以推断，进入人体的病毒也有类似的RBD。这使得多碱基切割位点的插入可以在人传人的过程中发生。
根据目前的序列数据，SARS-CoV-2最近的共同祖先估计出现在2019年11月下旬到12月初23，这一时间点与回顾性分析中最早确诊病例的出现时间相符24。根据这一情景推测，病毒从第一次发生动物传人事件，到最终获得多碱基切割位点，这之间存在一个未被发现的人传人阶段。如果之前已经有过多次动物传人事件，就会在较长时间内产生短链的人传人，提供足够的机会。这基本上就是MERS-CoV的传播过程，所有人类MERS病例都是病毒不断从单峰驼传给人，产生单个感染病例或最终形成了短链传播，所幸MERS-CoV没有适应在人类中的持续传播25。
研究储存的人体样本，或许能对这种隐性传播是否已经发生了做出判断。回顾性血清学研究也可以提供信息，已经开展的一些研究表明，中国的某些地区存在SARS-CoV样冠状病毒的低水平暴露26。然而关键的是，这些研究无法区分病毒暴露是来自之前感染的SARS-CoV还是SARS-CoV-2，抑或其他SARS-CoV样冠状病毒。需开展进一步的血清学研究，以确定之前人类的SARS-CoV-2暴露水平。
3.传代过程中的选择作用
在世界各地的二级生物安全实验室中，对蝙蝠SARS-CoV样冠状病毒在细胞培养和/或动物模型中传代的基础研究已经进行了多年27，也曾发生过SARS-CoV从实验室泄露的事故28。为此，我们必须考察是否存在因实验室疏忽而导致SARS-CoV-2泄露的可能性。
理论上，SARS-CoV-2在适应细胞培养传代的过程中获得RBD突变是可能的（图1a），这一点在对SARS-CoV的研究中已经观察到11。然而，在穿山甲的SARS-CoV样冠状病毒中发现了几乎相同的RBD，是SARS-CoV-2通过重组或突变获得这些RBD的一个更简洁有力的解释19。
此外，多碱基切割位点和推测的O连接聚糖的获得也不支持这一基于细胞培养的假设。低致病性禽流感病毒，无论在体内或体外，都只有在长时间传代后，才会出现新的多碱基切割位点17。而且，假设SARS-CoV-2是通过细胞培养或动物传代的方式产生的，则需要先分离具有高度遗传相似性的前体病毒，而这一工作尚未被报道。其后多碱基切割位点的出现也需要在细胞培养或在具有人ACE2受体相似受体的动物中重复传代，这类工作也未见报道。最后，推测的O连接聚糖也不太可能在细胞培养传代中出现，因为这些特征需要免疫系统的参与。
结论
面对席卷全球的COVID-19突发公共卫生事件，不免有人好奇为何鉴定这次大流行的起源如此重要。详细了解一种动物病毒如何打破物种屏障，如此快速地感染人类，将有助于预防未来的人畜共患事件。如果SARS-CoV-2是在另一种动物中先适应的，那么未来就有类似事件重演的风险。相反，如果适应过程是发生在人类身上，那么即使人畜传播再次发生，也不太可能在不发生一系列相同突变的情况下再次暴发。此外，如果能确定SARS-CoV-2在动物中传播的最近源病毒，将极大地推进对病毒功能的研究。事实上，之前蝙蝠病毒RaTG13序列的发布，就帮助揭示了关键的RBD突变和多碱基切割位点。
本文描述的基因组特征或许能部分解释SARS-CoV-2在人类中的传染性和传播力。尽管有证据证明，SARS-CoV-2并不是一种经过蓄意改造的病毒，但目前还无法证明或反驳这里提到的其他起源理论。不过，由于我们在自然界的近缘冠状病毒中观察到了SARS-CoV-2的所有显著特征，包括经过优化的RBD和多碱基切割位点，因此我们认为，任何实验室起源论都是不足信的。
更多科学数据的出现，可能会给一种假说提供更多证据。从动物来源获得近缘病毒的序列，将是揭示病毒起源的最佳方式。例如，进一步在动物的SARS-CoV-2样病毒中，发现正在形成或已形成的多碱基切割位点，将为自然选择假说提供进一步的支持。获得更多关于SARS-CoV-2的遗传和功能性数据，包括动物研究，也将大有帮助。鉴定出SARS-CoV-2的潜在中间宿主，以及对早期病例的病毒进行测序，同样会提供大量信息。无论SARS-CoV-2通过自然选择起源的确切机制为何，对人类和其他动物的肺炎进行持续监测无疑是重中之重的工作。
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文章来源：Nature自然科研 公众号
原文以The proximal origin of SARS-CoV-2为标题发表在2020年3月17日的《自然-医学》通讯上
